时间分辨荧光技术原理、仪器及应用在生物化学与医学领域的全面解析,广东营销推广团队
#网络推广 发布时间： 2025-02-08
时间分辨荧光技术具有两种测量方法：时间域和频域。由于时间分辨的结果数据比稳态荧光数据包含更多的信息，因此近年来，时间分辨荧光技术已成为生物化学和生物物理学领域的主要研究工具之一。荧光寿命成像技术可以同时获得有关分子状态和空间分布的信息，并且在生物学和医学领域也越来越广泛使用。以下将从原理，工具和应用的各个方面简要介绍时间分辨的荧光和荧光寿命测量技术。1荧光和荧光寿命的基本原理
吸收光后分子失活的原理和过程可以直观地用数字表示（图1是简化的表示）。简而言之，根据规则，分子中的单元基态电子能水平S0在分子中吸收特定波长的光子，并在单元激发电子能级（通常是S1状态）中的一定振动能级（通常是S1状态）。这个过程约为10-15；在短暂的振动松弛过程（约10-12-10-10）之后，大量电子将在S1状态的最低振动能状态下积聚。该州的电子将有几种释放能源并返回基态S0状态的方法。这些途径，包括振动松弛，被统称为停用过程。如果能量在能量释放过程中释放，则称为辐射失活。如果仅通过碰撞和其他手段释放能量，并且没有释放光子，则称为辐射失活。
荧光发射是常见的辐射失活过程。它通常是指电子从S1到S0状态并同时释放光子的过程。这个过程的时间通常在10-10-10-10-7之间。通过检测荧光发射强度随时间的变化，可以获得系统的荧光寿命信息。
有几种停用无辐射过程的方法：内部转换是指电子在具有相同多个程度的电子能状态之间的电子过渡的过程，时间通常在10-11到10-9s之间。系统之间的跨度是指电子。不同多个程度的能量状态之间的过渡过程，例如从单重S1到三重态T1的过渡，通常在10-10-10-10-8S之间。荧光淬灭是指通过分子和能量转化的激发分子的相互作用，从而释放能量，也称为外部转换。这些无辐射失活过程在确定系统的荧光寿命中起着非常重要的作用。
另外，在电子过渡到T1状态后，它们有可能以光子的形式过渡到S0状态，这称为磷光发射。否则它们将再次返回S1状态，并将光子释放回S0状态，该状态称为延迟荧光。由于空间限制，这两种类型的发光情况将在此处讨论。
2荧光衰减曲线和荧光寿命
在激发光源的照射下，荧光系统在各个方向发出荧光。当光源停止辐照时，荧光不会立即消失，但会逐渐衰减至0。根据上述原理，理想系统的荧光衰减可以严格得出。
假设其浓度为[A]（mol·l-1），则假设所有A分子的环境都处于近似状态，则稀释溶液A（mol·l-1），则溶液中所有A分子的荧光衰变途径是相同的。如果与该过程中涉及的速率常数相比，如果其持续时间可忽略不计，则可以认为其时间宽度为0。这种理想的线性光源称为Δ2脉冲。上面的溶液用Δ2脉冲激发。由于光吸收和振动弛豫的时间很短，因此可以考虑到时间为0时，一定数量的分子通过吸收光子来达到激发态S1。浓度为[1A3]表达。这些激发态的这些分子将通过辐射（以下是指荧光）或无辐射途径返回基态S0，它们的速率常数分别由KSR和KSNR表示。可以将此过程与主要反应进行比较，激发分子的衰减率可以通过公式（1）表示：
-d [1a3] dt =（ksr+ksnr）[1A3]（1）
整合公式（1），您可以在时间t处获得激发态分子的浓度与初始激发态浓度[1A3] 0：
[1A3] = [1A3] 0exp-tτs（2）
公式中的τ称为激发态S1的寿命，由公式（3）表示：
τs= 1ksr+ksnr（3）
荧光强度IF与激发态分子的浓度成正比，并且荧光辐射停用的速率常数：
if（t）= ksr [1a3] = ksr [1a3] 0exp-tτs（4）
使用荧光仪器测量时，观察到的荧光强度IF也与仪器的各种参数有关。因此，荧光强度与激发态的寿命之间的关系可以简单地表示为：
i（t）=αexp-tτ（5）等式（5）
它表明，在具有δ2脉冲作为激发光源的单个系统中，荧光强度衰减了单个指数衰减。观察到的荧光寿命τ等于S1状态的寿命τ，这不仅受荧光发射速率的影响，而且还受各种非辐射过程的影响。因此，直接测量的明显荧光寿命也称为自然寿命。
对于复杂的系统，由于每种荧光物质的不同特性或每种荧光物质所在的微观环境，因此整个系统的荧光衰变曲线的两条线是多个指数衰减功能的总结，称为多指数 - 指数衰减：
i（t）= ∑iαiexp-tτi（6）
基于激发光源是理想的线光源Δ2脉冲的情况（图2）获得上述荧光衰减曲线。实际上，任何实际的光源都有一定的宽度，因此在实际应用中，需要进一步纠正上述表达式。如果激发光源的强度表示为时间e（t）的函数，则检测到的信号r（t）可以表示为E（t）和δ2脉冲响应I（t）之间的卷积得分：
r（t）= e（t）ªI（t）=∫T0e（t'）i（tt'）dt'（7）
基于从上述理论推导得出的结论，可以设计具有荧光寿命的检测工具来分析测量结果并进一步获得系统的动态信息。
3测量时间分辨光谱法
3.1原理和方法
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